Estudio de la influencia de los factores de crecimiento en la producción in vitro de embriones bovinos

230 p.El objetivo del presente trabajo fue estudiar el posible efecto de la adición de factores de crecimiento a los medios utilizados en la producción in vitro de embriones de ganado bovino. Para ello se recogieron, mediante aspiración, CCOs a partir de ovarios de hembras sacrificadas en matadero. Los factores de crecimiento EGF, FGFb, IGF-I, PDGF, y la mezcla de todos ellos, EFIP, fueron añadidos al medio de maduración, al de cultivo (en día 1 o 3 postinseminación), o bien a ambos, comparándolos con la adición de FCS o con un medio carente de fuente proteica (Control). En todos los casos, los resultados obtenidos tras la adición de FCS fueron los mejores al proporcionar los mayores porcentajes de Blastocistos eclosionados, no pudiendo ser sustituido por ninguno de los factores de crecimiento. Por otra parte, la utilización de FCS resultó ser más beneficiosa cuando se hizo a partir del día 3 postinseminació

Criopreservación en embriones ovinos producidos in vitro en diferentes estadios mediante dos métodos de vitrificación

Diferentes protocolos de vitrificación han sido evaluados en los últimos años en embriones ovinos producidos in vivo. Sin embargo, ninguno de ellos permite una gran sobrevivencia cuando se aplica a embriones producidos in vitro. El objetivo de esta tesis fue evaluar dos nuevos métodos de vitrificación (Cryotop y Espátula) nunca antes evaluados en ovinos para la criopreservación de embriones al Día 2 o al Día 6 luego de la fertilización in vitro (Día 0). Complejos cumulus ovocitos fueron madurados, fertilizados y cultivados in vitro hasta el Día 8. Al Día 2 los embriones fueron asignados al azar a 5 grupos experimentales de los cuales dos grupos fueron vitrificados en el Día 2 por el método Cryotop o Espátula; dos grupos fueron vitrificados en el Día 6 por el método Cryotop o Espátula; y un grupo no fue sometido a vitrificación permaneciendo los embriones en cultivo in vitro como grupo control. Luego de la vitrificación y el calentamiento los embriones continuaron su desarrollo in vitro junto con el grupo control hasta el Día 8. Se determinó la tasa de sobrevivencia a las 3 h y 24 h luego del calentamiento, la tasa de desarrollo al Día 6, la producción de blastocistos al Día 8, y la tasa de eclosión al Día 8 sobre el total de blastocistos en ese Día así como sobre el total de embriones clivados en el Día 2. Asimismo se determinó el número total de células presentes en blastocistos expandidos en el Día 7. Los resultados demostraron que la tasa de sobrevivencia a las 24 horas luego de la vitrificación-calentamiento y la producción de blastocistos en el Día 8 se vieron afectadas por el estadio del embrión, siendo menor para aquellos vitrificados en el Día 2 comparados con embriones vitrificados en el Día 6 (P<0,05). Comparado con el grupo control sin vitrificar, los embriones vitrificados en el Día 2 presentaron una menor tasa de desarrollo en el Día 6 (P<0,05), no encontrando un efecto del método de vitrificación utilizado (Cryotop o Espátula) (P=NS). La tasa de eclosión sobre el total de los blastocistos presentes al Día 8 no estuvo afectada por la vitrificación, siendo similar a los embriones no vitrificados (P=NS). A pesar de que los embriones en estadios tempranos mostraron menor criotolerancia, aquellos embriones que sobrevivieron el proceso de vitrificación-calentamiento tuvieron una alta capacidad de desarrollo y de eclosión, similar a la vitrificación en los estadios de mórula o blastocisto. El número total de células no mostró diferencias entre los grupos experimentales evaluados. El método de vitrificación no afectó ninguna de las variables evaluadas, sin embargo, sí se encontró un efecto del estadio embrionario al momento de realizar la vitrificación. En conclusión, ambos métodos Cryotop y Espátula permiten una aceptable tasa de sobrevivencia y desarrollo en embriones ovinos producidos in vitro y vitrificados en el Día 2 o en el Día 6. La vitrificación mediante estos dos métodos de enfriamiento ultra-rápido y volumen mínimo representan una alternativa promisoria para embriones ovinos en diferentes estadios producidos por fertilización in vitro

Manual de transferencia de embriones

El instructivo está dirigido a investigadores, académicos y productores, tiene la finalidad de orientar sobre la técnica de una nueva alternativa para mejorar el índice de procreo con transferencia de embriones como una herramienta innovadora que consiste en la doble ovulación por inducción en bovinos de carne.CONACYT – Consejo Nacional de Ciencia y TecnologíaPROCIENCI

Maduración de ovocitos y desarrollo de embriones bovinos cocultivados en monocapas celulares

During the twentieth century, the introduction of innovative reproductive\nbiotechnologies in cattle production has allowed a breakthrough in this field. The embryo transfer produced by in vitro fertilization (IVF) increased significantly and\nin 2013 reached a global record high of 42% of transferred embryos. However, despite scientific efforts to optimize systems for in vitro production (IVP), the culture conditions remain suboptimal. Thus, the performance and quality of\nembryos are lower than those produced in vivo thereby generating higher early embryonic losses that negatively affect production.\nCoculture with somatic cells could improve suboptimal conditions and\npromote embryonic development through the production of mitogenic compounds\nand substances that promote cell differentiation. Also, through detoxifying and modifying embryotoxins concentrations and energy substrates. Besides, the\nstudy of coculture systems would provide valuable information about the\nrequirements for early embryonic development, biochemistry of somatic cells and their interaction with the embryo. The aim of this thesis is to optimize the bovine embryo production from IVF, using systems of coculture with granulosa and luteal cells from bovine, to\nincrease yield and/or quality of blastocysts produced. The effect of two coculture\nsystems with bovine granulosa cells: granulosa cells line 1 (BGC-1) and\ngranulosa cells from passage 1 after primary culture (CGB-1), on in vitro\nmaturation were assessed. Similarly, unpurified cells from a primary culture of\nbovine corpus luteum were used but the results were inconclusive. Furthermore,\nthe effect of a coculture system with purified bovine luteal cells of passage 1\n(CLB-1) during early embryonic development was evaluated. The presence of\nBGC-1 showed no beneficial effect on oocyte nuclear maturation compared to\nthe control group (without cells). Varying maturation rates were observed, and in\nmost cases, meiotic resumption was inhibited. By employing an alternative model with CGB-1 significantly increases the nuclear maturation rates (85%) compared\nto the control (70%). However, there were no differences in Annexin V-FITC rate (determination for early apoptosis) or dead rate in oocyte between groups. Also, late apoptosis (TUNEL assay) was evaluated and there were no differences\nbetween groups (CGB-1: 1.12% vs. control 1.33%). After IVM, oocyte levels of\nreactive oxygen species (ROS) were determined using DCHFDA assay and it\nshowed a significant increase in coculture group with CGB-1. As an indirect\nassessment parameter of oocyte cytoplasmic maturation, IVF assays were\nperformed. In this case, the control group received the gonadotropins. The\ncleavage rate was determined at 48 h post-IVF and was similar in both groups (CGB-1: 80.5% vs. control: 79.4%). However, blastocysts rate was significantly lower in control than the coculture (CGB-1: 14% vs. control: 25.6%).\nThe embryo coculture with CLB-1 was performed during the first 48 h of in\nvitro culture (IVC). The CLB were previously isolated and purified by differential\ncentrifugation on a discontinuous Percoll? density gradient, and the purity was determined by immunocytochemistry (ICC) using antibodies against 3?-HSD (enzyme that catalyzes progesterone biosynthesis from pregnenolone). All the\ncells selected (fractions 5 and 6 of the Percoll? gradient) were positive to 3?HSD. Nile red dye was used to detect cytoplasmic lipid droplets and all the cells\nassessed were positive indicating steroidogenic activity preserved. On the other hand, cells from passage 1 without selection showed 80.6% ± 7,02 of positive cells. This coculture system modified the kinetic of embryo development respect to a conventional system that not uses cells (control). A significantly increase in blastocyst rate (CLB-1: 50% vs. control: 30%) and stage 6-blastocyst rate (CLB1: 37% vs. control: 24%) was observed. The ROS level was measured in day 2- embryos and was significantly higher in the coculture. Furthermore, the detection of the proliferation antigen Ki-67, as an early marker of embryo quality, was proposed. The cell proliferation rate and the mean number of blastomeres were\ndetermined in day 2-embryos using immunofluorescence for Ki-67 and Hoechst\n33342 staining. The cell proliferation rate in embryos cultured with CLB-1 was\nsignificantly higher than the control but there were no differences in a mean\nnumber of blastomeres. Late apoptosis (TUNEL assay) was assessed in blastocysts and the rate of apoptotic blastomeres was lower in coculture with CLB-1 than the control (4.10% vs. 10.90%). In conclusion, the coculture system with BGC-1 is not an alternative to\noptimize PIV of the bovine embryo. On the other hand, the coculture with CGB-1\nshowed a positive effect on nuclear maturation but their use was not superior\nregarding efficiency about traditional PIV system. The effects of this coculture\nwere evident delayed, and the lower yield may be associated with an increased level of ROS in oocytes. Finally, the use of CLB-1 in coculture during early embryo\ndevelopment showed a significant embryotrophic effect with high blastocyst yield of a better quality, thereby optimizing the PIV of the bovine embryo.\nFil: Maruri, Alejandro. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Veterinarias. Buenos Aires. ArgentinaDurante el siglo XX, la introducción de biotecnologías reproductivas\ninnovadoras en la producción bovina le ha permitido a la ganadería un gran avance. La transferencia de embriones producidos por fecundación in vitro (FIV) aumentó significativamente, alcanzando en el año 2013 un máximo histórico a\nnivel mundial de 42% del total de embriones transferidos. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos científicos para optimizar los sistemas de producción in vitro (PIV), las condiciones de cultivo continúan siendo subóptimas. En consecuencia,\nel rendimiento y la calidad de los embriones es inferior respecto a los producidos\nin vivo lo que genera mayores pérdidas embrionarias, afectando negativamente\nla producción.\nEl cocultivo con células somáticas podría mejorar las condiciones\nsubóptimas y favorecer el desarrollo embrionario a través de la producción de\ncompuestos con actividad mitogénica y sustancias que promueven la\ndiferenciación celular, la detoxificación de embriotoxinas y la modificación de las\nconcentraciones de sustratos energéticos. Asimismo, el estudio de sistemas de cocultivo podría proporcionar información valiosa sobre los requerimientos para\nel desarrollo embrionario temprano, la bioquímica de las células somáticas y su\ninteracción con el embrión.\nEl objetivo general de la tesis es optimizar la producción de embriones\nbovinos obtenidos por FIV, a través de la utilización de sistemas de cocultivo con\ncélulas de granulosa y luteales bovinas, para incrementar el rendimiento y/o la calidad de los blastocistos obtenidos a través de dicha biotecnología. Se evaluó\nel efecto de dos sistemas de cocultivo con células de granulosa bovina durante\nla maduración in vitro (MIV): células de la línea BGC-1 (bovine granulosa cell line\n1) y células del primer pasaje luego del cultivo primario (CGB-1). Paralelamente,\nse utilizaron células de pasaje 1 de cultivo primario de cuerpo lúteo bovino sin\npurificar, no obteniéndose resultados concluyentes. De igual modo, se evaluó el\nefecto de un sistema de cocultivo con células luteales bovinas purificadas de pasaje 1 (CLB-1) durante el desarrollo embrionario temprano. La presencia de\nBGC-1 no demostró tener un efecto beneficioso sobre la maduración nuclear \novocitaria respecto al grupo control (sin células). Se observaron porcentajes\nvariables y en la mayoría de los casos la reanudación meiótica fue inhibida. Al\nemplear como modelo alternativo las CGB-1, se incrementó significativamente el\nporcentaje de maduración nuclear (85%) respecto al control (70%). Sin embargo,\nlos porcentajes de ovocitos Anexina V-FITC positivos (determinación para\napoptosis temprana) y de ovocitos muertos luego de la MIV no mostraron\ndiferencias entre el cocultivo con CGB-1 y el control. También, se evaluó la\napoptosis tardía (ensayo TUNEL) sin observar diferencias entre los grupos\n(CGB-1: 1,12% vs. control: 1,33%). Los niveles ovocitarios de especies reactivas derivadas del oxígeno (ERO) se determinaron a través del ensayo de DCHFDA\nluego de la MIV, observando un incremento significativo de los mismos en el\ncocultivo con CGB-1. Como parámetro indirecto de evaluación de la maduración\ncitoplasmática se realizaron experimentos de FIV, en cuyo caso se agregaron\ngonadotrofinas al medio de MIV en el grupo control. El porcentaje de embriones\nsegmentados se determinó a las 48 h post-FIV y fue similar en ambos grupos\n(CGB-1: 80,5% vs. control: 79,4%). Sin embargo, el rendimiento de blastocistos\nfue significativamente menor en el cocultivo (CGB-1: 14% vs. control: 25,6%).\nEl cocultivo de embriones con CLB-1 se realizó durante las primeras 48 h\nde cultivo in vitro (CIV). Las CLB se aislaron y purificaron previamente mediante\ncentrifugación diferencial en un gradiente discontinuo de Percoll®, determinando\nla pureza mediante inmunocitoquímica (ICQ) para 3?-HSD (enzima que cataliza la biosíntesis de progesterona a partir de la pregnenolona). Se observó que la totalidad de las células de pasaje 1 que habían sido seleccionadas (fracciones 5\ny 6 del gradiente de Percoll®) fueron positivas a 3?-HSD. Utilizando el colorante rojo Nilo se determinó la presencia de vacuolas lipídicas citoplasmáticas en la\ntotalidad de las células evaluadas, lo cual indicó actividad esteroidogénica\nconservada. Del mismo modo, las células de pasaje 1 sin selección mostraron\nun porcentaje del 80,6% ± 7,02 de positividad al colorante. El cocultivo con este sistema modificó la cinética de desarrollo embrionario respecto al sistema convencional sin células (control). Se observó un incremento significativo del porcentaje de blastocistos (CLB-1: 50% vs. control: 30%) y de blastocistos de\nestadio 6 (CLB-1: 37% vs. control: 24%). Los niveles de ERO se determinaron\nen embriones de día 2, siendo significativamente superiores en el cocultivo. Por otro lado, se planteó la detección del factor de proliferación celular Ki-67 como marcador temprano de calidad embrionaria. Mediante inmunofluorescencia para\nKi-67 y tinción con Hoechst 33342 se determinó el porcentaje de proliferación\ncelular y el número promedio de blastómeras en embriones de día 2. El\nporcentaje de proliferación celular en los embriones cocultivados con CLB-1 fue\nsignificativamente mayor respecto al control sin existir diferencias en el número\nde blastómeras. Se evaluó la apoptosis tardía (ensayo TUNEL) en blastocistos,\nobservando un menor porcentaje de blastómeras apoptóticas en el cocultivo con CLB-1 respecto al control (4,10% vs. 10,90%).\nEn conclusión, el sistema de cocultivo con BGC-1 no es una alternativa\npara optimizar la PIV de embriones bovinos. Sin embargo, el cocultivo con CGB1 mostró un efecto positivo sobre la maduración nuclear ovocitaria, no obstante, su utilización no resultó ser superior en términos de eficiencia respecto al sistema\nde PIV tradicional. Los efectos de este sistema de cocultivo se evidenciaron\ntardíamente y los menores rendimientos podrían asociarse a los mayores niveles de ERO en los ovocitos. Finalmente, la utilización de CLB-1 purificadas y en\ncocultivo durante las etapas tempranas de desarrollo demostró un marcado\nefecto embriotrófico con altos porcentajes de blastocistos de mejor calidad, optimizando la PIV de embriones bovinos

Desarrollo embrionario y estrategias antiluteoliticas hormonales en programas de transplante de embriones bovinos

Durante el desarrollo embrionario se establecen múltiples interacciones entre hormonas, factores de crecimiento (FC) y diferente tipo de moléculas, con lo cual se genera una serie de señales que desencadenan el reconocimiento materno de preñez (RMP) entre los días 15 y 17, momento en el cual se genera un “periodo crítico”, cuando el endometrio libera la hormona prostaglandina F2α (PGF2 )para causar regresión del cuerpo lúteo (CL), en el cual se sintetiza progesterona (P4), hormonaα encargada de favorecer un adecuado ambiente uterino para el desarrollo embrionario y el mantenimiento de la preñez. El embrión en desarrollo genera señales antiluteolíticas que bloquean la producción de la PGF2 , por lo que se podría sugerir que el mantenimiento de la preñez es dependiente de la efectividadα de este bloqueo, entre otros factores; el cual es generado por la acción del Interferón tau (IFN-τ), producido en las células mononucleares del trofoblasto embrionario. Este bloqueo garantiza la integridad del CL y de esta forma la producción normal de P4. Por lo anterior se podría pensar que la manipulación estratégica apoyada hormonalmente, mejora las condiciones para el efectivo bloqueo de los agentes luteolíticos que tienen su mayor actividad durante el llamado “periodo crítico”, con lo cual se mejora la tasa de sobrevivencia en programas de transplante embrionario ya que se crearía un ambiente uterino adecuado para el establecimiento y normal desarrollo del embrión. Por esto mismo, últimamente se han planteado mecanismos de apoyo hormonal que causan un bloqueo apropiado en cuanto a la producción de PGF uterina durante los días15 y 17 del ciclo estral

Factores que afectan la eficiencia reproductiva y los bajos índices de preñez de la hembra receptora en un programa de transferencia de embriones bovinos en Colombia.

FigurasLa transferencia de embriones en ganado bovino es una de las biotecnologías más difundidas en el mundo, ha tenido gran impacto a nivel zootécnico pues ha permitido incrementar la descendencia de reproductores de alto valor genético y ha venido difundiéndose muy marcadamente en los últimos años en Colombia. Sin embargo esta biotecnología que tiene un enorme potencial de mejoramiento genético se encuentra limitada por varios factores que disminuye su aplicación. Con el objeto de incrementar la eficiencia en estos programas se realizó una revisión bibliográfica de los factores que afectan la eficiencia reproductiva de la hembra receptora en un programa de transferencia de embriones bovinos tales como los aspectos asociados a la hembra donante, al embrión, aplicación de la técnica, a la hembra receptora, sincronismo donante-receptora, sincronismo embrión-receptora, desarrollo postransplante del embrión y finalmente se evaluaron algunas alternativas para incrementar las tasas de preñez. Palabras claves: biotecnologías, genética, embrión, sincronismo, transplante, micromanipulaciónEmbryo transfer is one of the most widespread biotechnologies in the world and has had great impact on zoo technical level it has increased the offspring of high genetic value players and has been spreading very sharply in recent years in Colombia. However this biotechnology has enormous potential breeding is limited by several factors decreasing its application. In order to increase the efficiency of these programs a literature review of the factors affecting reproductive efficiency of the host female in a transfer program such as bovine embryos aspects associated with the female donor, the embryo was performed application technique, the receiving female donor-recipient synchronization, sync embryo-recipient, post-transplant embryo development and finally some alternatives were evaluated to increase pregnancy rates. Keywords: biotechnology, genetics, embryo, sync, transplant, micromanipulation

Manual de Procedimientos de producción in vivo de embriones bovinos

La primera transferencia de un embrión de la especie bovina fue reportada por Unbaugh en el año de 1949 y el nacimiento del primer becerro producto de la transferencia de embriones fue dos años después (Willet et al., 1951). La aplicación de la transferencia de embriones con todas las biotecnologías que implica, se inició en la década de 1970, cuando el sistema de producción de ganado bovino doble propósito de Europa se hizo popular en Norte América, Australia y Nueva Zelanda (Seidel y Seidel, 1991). La técnica de transferencia embrionaria fue establecida alrededor de los años setenta. Inicialmente, era exclusivamente quirúrgica, sin embargo, hacia los años ochenta la mayoría de embriones eran transferidos mediante la técnica no quirúrgica (Jones y Lamb, 2008).El uso de las biotecnologías de la reproducción animal tiene como objetivo principal el hacer más rentables todas las unidades de producción. Es por ello que la producción in vivo de embriones bovinos, surge con la finalidad de producir una mayor cantidad de animales seleccionados con elevada calidad genética, dentro del menor tiempo posible. La información presentada, se recabó a través de la búsqueda y análisis de literatura en diferentes fuentes especializadas. Este manual tiene como objetivo el brindar información clara y suficiente para que el lector conozca los diferentes aspectos a considerar, para poder aplicar las biotecnologías que implica la producción in vivo de embriones bovinos. La información presentada abarca desde los inicios de la puesta en marcha de las primeras biotecnologías reproductivas que se desarrollaron previamente, hasta lograr la puesta en marcha de los programas de transferencia embrionaria en una unidad productiva

Comparación de dos protocolos de sincronización del celo en ganado lechero Jersey de la finca La Teresita en el municipio de Dosquebradas, Risaralda

Es necesario emplear métodos o tecnologías con el objetivo de conseguir una constante mejora reproductiva y un aumento en la producción, siendo estos aspectos muy importantes en las producciones pecuarias. La sincronización de celos ha sido una diseñada para facilitar los procesos de inseminación artificial y disminuir los costos del control de celo. Con el objetivo de comparar la eficiencia de dos protocolos de sincronización de celos y ovulación en ganado lechero de la finca La Teresita, del municipio de Dosquebradas, con dos tratamientos hormonales. Se emplearon un total de 20 vacas Jersey vacías que estuvieran entre el 3 y 6 parto, separándolas en dos grupos para la aplicación de los 2 tratamientos. Los animales presentaban las mismas condiciones de manejo y de crianza extensiva al pastoreo. Para el trabajo en campo se hizo uso de Gestavec® (progesterona) y Estrozoo® (benzoato de estradiol) para el protocolo número 1 y DIB® (progesterona), Estrumate® (cloprostenol) y Estrozoo® (progesterona y benzoato de estradiol) para el protocolo número 2. La ejecución del tratamiento 1 y del tratamiento 2 tomó un total de 7 y 9 días respectivamente hasta el momento de la inseminación artificial para la que se empleó semen congelado de origen nacional, procedente del mismo toro. A los 2 meses de ser inseminadas las vacas, se efectuó el diagnóstico de gestación mediante palpación rectal. Para el análisis estadístico de los resultados obtenidos se utilizó la prueba Chi cuadrado, indicando que no existían diferencias estadísticamente significativas entre los dos protocolos, obteniendo un total de 5 preñeces de las 10 vacas estudiadas en cada protocolo

Clonación de gametas y transgénesis mediada por fertilización in-vitro en bovinos

En la presente tesis se desarrolló un método de clonación del genoma del espermatozoide y del ovocito bovino mediante la producción de embriones androgenéticos y partenogenéticos haploides. Esta técnica también fue utilizada para generar embriones bovinos que expresan un gen exógeno (transgen) en forma homogénea. Las tasas de desarrollo de los embriones reconstruídos utilizando genomas espermaticos clonados (blastomeras androgenéticas), alcanzaron 85.1 por ciento de clivaje, 9 por ciento de blastocistos y todos los embriones expresaron el transgen (EGFP) durante el desarrollo in-vitro. Las tasas de clivaje y de blastocistos de los embriones reconstruídos utilizando genomas clonados de ovocitos (blastomeras partenogenéticas), alcanzaron 78.4 por ciento y 10.8 por ciento respectivamente. Todos los embriones reconstruidos utilizando blastomeras partenogenéticas que expresaban el transgen mostraron expresión de EGFP y el 96.6 por ciento de ellos en forma homogénea. Posteriormente se desarrolló un nuevo método de transgenesis que permite transfectar cigotos de fertilización in vitro (FIV) y ovocitos activados partenogeneticamente (AP). El 70 por ciento de los embriones clivados y el 50 por ciento de los blastocistos expresaron EGFP cuando complejos pCX-EGFP-liposomas fueron inyectados 16 h post-fertilizacion y utilizando una concentración de 500 ng ADN exógeno.ƒÊl. Al inyectar ovocitos 3 h post-activación partenogénetica se obtuvo una tasa de expresión de 48.4 por ciento. Por otro lado, evaluamos la incidencia de fragmentación del ADN tras la inyección del transgen, demostrando que su expresión afecta la integridad del ADN en blastocistos bovinos de FIV, pero no así las tasas de desarrollo in vitro. En resumen, la presente tesis conforma una base sólida para concluir que es posible la clonación de genomas de ovocitos y espermatozoides con capacidad de generar embriones biparentales que evolucionan hasta estadio de blastocisto. Además, este procedimiento demostró ser una herramienta eficiente para la incorporación de genes exógenos en un embrión. Finalmente se demostró que la inyección intracitoplasmática de liposomas es una estrategia eficiente para introducir ADN exógeno en embriones de FIV y AP

Modificaciones epigenéticas en clonación porcina

The somatic cells nuclear transfer technique (SCNT) or animal cloning, involves transferring the nucleus of a somatic donor cell into the cytoplasm of an oocyte that has been previously removed its nucleus, in order to obtain the necessary machinery to generate an embryo. However, it is a highly inefficient method and requires technical improvements.\nCloning has various applications in animal production. However, is still not entirely clear the mechanisms of nuclear remodeling and reprogramming that must suffer to become an embryo. A variety of factors probably contribute to this inefficiency, from the quality of oocytes to the type of donor cell. The failure to adequately reprogram the transplanted nucleus could be due to a deficient imprinting in somatic nuclei reconstituted embryo. To resolve the reprogramming failures we utilized in embryos the embryo aggregation technique and applied drugs that modify the epigenetic.\nAt the beginning of this study, partenogenetics embryos were used with these drugs that induce changes in methylation and histone acetylation, obtaining a combination of drugs (1 uM 5 Azacitidine + 1 uM PD0325901) which showed a tendency to increase in vitro embryo development. Subsequently, we continued to perform embryo aggregation, generating two groups: (1x) control and (3x) aggregates. The aggregated embryos increased in vitro development rates not involving a greater use of oocytes, also increased size measured by embryonic diameter, however, no statistically differences were found in the number of cells, apoptosis cell or DNA fragmentation between both groups.\nWhen we worked in swine clones, embryo aggregation in the one cell stage showed that were not required additional oocytes to produce higher rates of blastocyst resulting in an increase in the diameter and number of embryonic cells, while the level apoptosis was statistically lower in 3x aggregates embryos . This could prove partial compensation possibly caused by the combination of three different epigenetically embryos that had higher pluripotency gene expression . Moreover, by improving in vitro development, number of cells, embryonic diameter and decrease levels of apoptosis was improving embryonic reprogramming, obtaining better quality embryos.\nIn the last chapter of this thesis, we combined the embryo aggregation method and the use of drugs that induce epigenetic modifications in the early embryo development. This was encompass several aspects involving nuclear reprogramming, gene expression, showing marks relative to histones and DNA methylation. As a result, the treated 3x group showed an increase in embryonic size without involving changes in cell number. Also it showed an increase in gene expression related to trophoblast, involved in embryonic placentation, as in antiapoptotic genes and in the MAPK pathway genes involved.\nAnother change was displayed in the redistribution of acetylated histone H3 lysine 27 (H3K27ac). This is preferably located in the nuclear perisferia. Histone H3 with a methyl group at lysine 4 (H3K4me1) did not modify their distribution within the core, showing a homogeneous distribution. Regarding DNA methylation, Oct4 and Dnmt1 presented a marked demethylation, showing that the drug 5 Azacitidine, acting on methylation, generated changes in the embryos.\nIn conclusion, this work generated a contribution to the study of embryonic reprogramming that must suffer embryos during cloning, covering different variables that affect the reprogramming process.Fil: Buemo, Carla Paola. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Farmacia y Bioquímica. Buenos Aires, ArgentinaLa técnica de transferencia de células somáticas (SCNT) o clonación animal, consiste en transferir el núcleo de una célula somática donante dentro del citoplasma de un ovocito al que se le ha eliminado previamente su núcleo, con el objetivo de obtener la maquinaria necesaria para generar un embrión. Sin embargo, es una técnica altamente ineficiente y requiere de mejoras.\nLa clonación tiene diversas aplicaciones en producción animal. No obstante, siguen sin estar del todo claro los mecanismos de remodelación y reprogramación nuclear que debe sufrir el embrión para que llegue a ser viable. Una variedad de factores probablemente contribuyen a esta ineficiencia, desde la calidad de los oocitos hasta el tipo de célula donante. El fracaso para reprogramar el núcleo trasplantado adecuadamente podría deberse a la deficiente impronta somática en los núcleos del embrión reconstituído. Para resolver las fallas en la reprogramación se recurrió a la técnica de agregación embrionaria y al uso de drogas modificadoras de la epigenética embrionaria.\nAl principio del trabajo se utilizó embriones partenogénicos, en ellos se probaron fármacos que inducen modificaciones en la metilación y la acetilación de histonas, obteniendose una combinación de drogas (5 Azacitidina 1?M + PD0325901 1 ?M ) que demostró una tendencia a aumentar el desarrollo embrionario in vitro. Posteriormente se prosiguió a realizar la agregación embrionaria, generándose dos grupos: el control (1x) y los agregados (3x), en los que tres embriones reconstituídos formaban parte del mismo embrión. En los embriones agregados aumentaron las tasas de desarrollo in vitro no implicando un mayor uso de oocitos, se incrementó el tamaño medido en diámetro embrionario, sin embargo, no se encontraron diferencias estadísticas significativas en el número de células ni en la apoptosis celular o fragmentación del ADN entre ambos grupos.\nCuando se pasó a trabajar en los clones porcinos, la agregación embrionaria en la fase de una célula demostró que no fueron necesarios oocitos adicionales para producir mayores tasas de blastocistos obteniendose un aumento en el diámetro y en el número de células embrionarias, mientras que el nivel de apoptosis fue estadísticamente más bajo en los embriones agregados 3x. Ésto podría demostrar una compensación parcial causada posiblemente por la combinación de tres embriones epigenéticamente diferentes que presentaban una mayor expresión de genes de pluripotencia. Por otra parte, al mejorar desarrollo in vitro, número de células, el diámetro embrionario y disminuir los niveles de apoptosis se estaba mejorando la reprogramación embrionaria, obteniendose embriones de mejor calidad.\nEn el último capítulo de la tesis se combinó el método de agregación embrionaria y los fármacos inductores de modificaciones epigenéticas en el embrión temprano. Se trató de abarcar varios aspectos que involucran la reprogramación nuclear mostrando expresión génica en relación a marcas de histonas y a metilación del ADN. Como resultado, el grupo 3x tratado con las drogas presentó un aumento en el tamaño embrionario, sin implicar cambios en el número celular. También presentó un incremento en la expresión génica en genes claves para el desarrollo de trofoblasto, implicados en la placentación embrionaria, al igual que en genes antiapoptóticos y genes implicados en la vía MAPK. Otro de los cambios visualizados fue la redistribución de la histona H3 acetilada en la lisina 27 (H3K27ac). Ésta se ubicó preferentemente en la perisferia nuclear. La histona H3 con un grupo metilo en la lisina 4 (H3K4me1) no modificó su distribución dentro del núcleo, mostrando una distribución homogénea. Respecto a la metilación del ADN tanto el gen que codifica para Oct4 como el que codifica para la enzima Dnmt1 presentaron una desmetilación marcada, mostrando que la droga 5 Azacitidina, que actúa sobre la metilación, estaba generando cambios en los embriones estudiados.\nComo conclusión, éste trabajo generó un aporte al estudio de la reprogramación embrionaria que deben sufrir los embriones provenientes de clonación, abarcando distintas variables que afectan el proceso de reprogramación